Видео смотреть бесплатно
Смотреть измена видео
Официальный сайт oriflame100 24/7/365
Смотреть видео бесплатно
|
||||||||||||
|
РефератыБиология (1263)Генная инженерия
Размер: 358.27 KB
Скачан: 477 Добавлен: 10.11.2006 СОДЕРЖАНИЕ Введение. 2
1.1. Открытие двойной структуры ДНК и матричного синтеза. 3 ГЛАВА 2. ВОЗМОЖНОСТИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ. 14 2.1. ЧТО БУДЕТ СДЕЛАННО ПОСЛЕ ЗАВЕРШЕНИЯ АНАЛИЗА ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА. 18 Глава 3. Области практического применения генной инженерии. 20 3.1. Создание трансгенных растений. 20 Глава 4. Перспективы клонирования животных 34 Введение. Генная инженерия - направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК ; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования. ГЛАВА 1. Теоретические предпосылки формирования генной инженерии как науки.
Начальные работы американских учёных Уотсона и Крика были произведены в Была открыта двойная структура ДНК и постулирован её матричный синтез. По тому же самому механизму осуществляется сборка РНК, только не двух спиралей, а одной. Этот процесс получил название – транскрипция. Поток информации в клетке обеспечивает реакции матричного синтеза: репликация Казалось бы, что на рубеже 70-х годов молекулярная биология достигла определённой степени завершенности: были установлены структура и механизм репликации ДНК, провозглашена «центральная догма» экспрессии гена В прошлом генетика и медицинская генетика развивалась как относительно независимые отрасли науки, теперь многие из их разделов оказались вовлечённые в общее русло молекулярно-генетических исследований, и провести между ними грань – трудно. Сейчас, множество ученых заняты различными работами связанные с проблемами генной инженерии – это и методы, основанные на использовании рестриктационных ферментов, анализ гена человека, методы гибридизации нуклеиновых кислот, секвенирование ДНК, сортировки хромосом при помощи цитофиурометрииии и многое, многое другое. Попытаюсь дать необходимые разъяснения по важнейшим работам из этого ряда.а Начнём с условий, которым должен соответствовать ген человека, что бы получить полную характеристику его структуры: 1) соответствующие фрагменты ДНК должны быть идентифицированы однозначно. 2) они должны быть выделены и накоплены в количестве, должностном для биохимического анализа. 3) должна быть определена вся нуклеотидная последовательность. Принципы, на которых основаны эти три метода, кратко будут описаны ниже. Мы начнем с описания второго, поскольку прогресс в выделении и клонировании генов был решающим для развития новой генетики. 1.2.РЕСТРИКТАЦИОННЫЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ. _ґ_ьї0’чїяяяяёПb_\Jчї_____ различные штаммы E-coli, Арбер обнаружил, что ДНК этого фага при переходе через бактерию разрезается и теряет свою инфекционность. 1.3.ПРИНЦИПЫ ТЕХНОЛОГИЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК. Было выделено много рестриктаз(более 150),расщепляющих ДНК в специфических сайтах. Например эндонуклеаза R1 регистрирует двухцепочную ( G-A-A-T-T-C ||| || || || || ||| C-T-T-A-A-G ( Липкие концы различных молекул ДНК, расщеплённых этим ферментом, могут вступать по четырём –A-T-парам. Рестриктационные эндонуклеазы различаются по тем сайтам ДНК, которые они распознают и разрезают. Их можно использовать для различных целей. Однако наиболее распространенным этапом является их применение для амплификации специфической определения нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, необходимо для ДНК или для изучения механизмов экспрессии генов. Последняя проблема наиболее важна в практическом аспекте: гены контролирующие образование функционально активных белков, теперьможно вводить в бактерии и размножать(амплифицировать).эта процедура называется клонированием генов. Плазмиды реплицируются автономо и сами могут содержать гены, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам или контролирующие синтез веществ, например: колицинов, убивающих другие бактерии(см. рис.1). Плазмидную ДНК можно выделить и ращепить подходящей рестриктазой только в одном сайте, превратив кольцевую молекулу в линейную с липкими концами. Рис. 1. Клетка E-coli с хромосомой и плазмидой. Рекомбинантную конструкцию вводят затем в бактерию, где она реплицируется (см. рис.2 ) Рис. 2. Принцип введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду с использованием эндонуклеазы. Источник экзогенной ДНК не имеет значения. ДНК может быть получена, например, из клеток человека, но можно сшивать и искуственно синтизированные гены. Кроме бактериальных плазмид в качестве векторов Добиться репликации и амплификации в составе плазмидной (или фаговой) 1. Как распознавать клоны, содержащие гибридную ДНК, среди потомства трансформированных клеток или живых бактериофагов ? 1. как идентифицировать необходимые фрагменты ДНК среди многих клонированных неизвестных фрагментов? Например можно отбирать бактериальные клетки, если они несут плазмиду с фактором устойчивости к антибиотику, выращивая их на среде, на среде, содержащей антибиотик. Нетрансформированные клетки без плазмид(и, следовательно, без гена устойчивости к антибиотику) просто не будут расти на такой среде. В последнее время разработано много специальных методов вакцинации, которые позволяют отбирать только рекомбинантные клетки. Для генной инженерии белков недостаточно отобрать и размножить определённые фрагменты ДНК, необходимо ещё индуцировать их экспрессию в клетке. Для этого необходимо «подключить» рекомбинантную молекулу ДНК , последующую трансляцию матричной РНК и процессинг как на транскрипционном , так и на трансляционных уровнях. 1.4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ГЕНОВ. Ещё одна область применения рестриктаз – идентификация и определение числа генов. Эти задачи решаются с помощью метода разработанного Саузерном. Тотальную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на Зонды и генные библиотеки. Главное условие такого анализа - наличие подходящего геноспецифического радиоактивного ДНК-зонда, который можно использовать для гибридизации. 1.5. ГИБРИДИЗАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ. Способность к гибридизации цепей ДНК лежит в основе многих методических приёмов молекулярной биологии, поэтому более подробное описание принципа гибридизации будет полезным. Большинство природных ДНК встречается в виде двухцепочных молекул. Их устойчивость поддерживается благодаря тому, что пиримидиновое основание цитозин(C) спаривается с пуриновым основанием гуанином(G), в то время как пиримидиновое основание тимин(T) спаривается с пуриновым основанием аденином(A). Эти комплиментарные пары оснований удерживаются водородными связями(тремя в паре G-C и двумя в паре A-T), которые относительно легко разрываются, при этом одноцепочные фрагменты "ПРОГУЛКА ПО ХРОМОСОМЕ". Метод гибридизации полезно использовать, например, для анализа очень протяженного гена. При этом с помощью подходящего зонда из геномной библиотеки ДНК первоначально извлекается какая-то часть такого гена. Нуклеотидная последовательность этой части гена будет, как правило, длинее зонда, и её концы будут перекрываться с другими фрагментами данного гена в этой библиотеке,то есть будут, по крайней мере, частично гибридизироваться с ними. Свободные концы этих фрагментов будут гибридизироваться со следующими и так далее, пока весь структурный ген не будет полностью идентифицирован серией перекрывающихся фрагментов. Именно таким образом был реконструирован структурный ген фактора свертывания крови VII человека, необычно длинный, состоящий из 180000 пар нуклеотидов. Существующий метод гибридизации in situ, этот метод уже усовершенствован на столько, что с его помощью можно локализовать в хромосомах даже уникальные гены, такие как ген инсулина. Вот пример некоторых генов человека, идентифицированных с помощью гибридизации(таблица ТАБЛИЦА 1. Некоторые гены человека, идентифицированные с помощью гибридизации. |Ген, длина последовательности ДНК и число копий. |Локализация. | 1.6. СОРТИРОВКА ХРОМОСОМ. Следующий метод – это метод сортировки хромосом при опмощи цитофлюрометрии. Этот метод может быть использован в двух разных целях: 1) Для идентификации и количественного анализа большого числа хромосом в течение очень короткого времени. 2) для препаративного разделения хромосом. Этот метод имеет два преимущества перед стандартными методами анализа хромосом: во-первых, он полностью автоматический, благодаря чему исключается элемент субъективности во-вторых, он намного быстрее (рис.3) Однако важнее, что этот метод позволяет препаративно разделять хромосомы, и при наличии специфических зондов исследовать структуру и функцию отдельных генов становится относительно просто. В этом случае ген можно локализовать в хромосоме с помощью гибридизации in situ, размножить его ДНК путём клонирования и секвенирования. Рис. 3. Принцип сортировки хромосом с помощью лазера. Хромосомы окрашены флуоресцирующим красителем. Флуоресценция возбуждается лазерным лучом и измеряется для каждой хромосомы отдельно. Данные измерений используют для сортировки хромосом. 1.7. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК. Последовательность нуклеотидов и генетический код. Методы определённой последовательности аминокислот в полипептидной цепи были известны ещё в 50-х годах. Теоретически это относительно лёгкая проблема, поскольку все 20 аминокислот, встречающихся в природных белках, имеют разные свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность 1.8.ДИНАМИЧНОСТЬ ГЕНОМА. Методы новой гентики расширили наши знания о структуре генетического материала. В 1963 году Тэйлор описал “индуцированные фагом мутации E. Стр 142 рис 2.95 НАРИСУЕМ САМИ Итак, из выше изложенного можно сделать следующее заключение, что теоретическими предпосылками формирования генной инженерии как науки, явились: 1. Открытие двойной спирали ДНК. 1. Получение информации о матричном синтезе: 3. Открытие плазмид. 4. Открытие фрагментов рестриктаз. 5. Осуществление процесса рекомбинации хромосом 6. Идентификация и анализ генов. 6. Способность к гибридизации цепей ДНК. 6. Секвенирование ДНК. ГЛАВА 2. ВОЗМОЖНОСТИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ. Значительный прогресс достигнут в практической области создания новых продуктов для медицинской промышленности и лечения болезней человека ТАБЛИЦА 2. Использование генно-инженерных продуктов в медицине. В настоящее время фармацевтическая промышленность завоевала лидирующие позиции в мире, что нашло отражение не только в объёмах промышленного производства, но и в финансовых средствах, вкладываемых в эту промышленность (по оценкам экономистов, она вошла в лидирующую группу по объёму купли-продажи акций на рынках ценных бумаг). Важной новинкой стало и то, что фармацевтические компании включили в свою сферу выведение новых сортов сельскохозяйственных растений и животных, и тратят на это десятки миллионов долларов в год, они же мобилизировали выпуск химических веществ для быта. Добавок к продукции строительной индустрии и так далее. Уже не десятки тысяч, а возможно, несколько сот тысяч высококвалифицированных специалистов заняты в исследовательских и промышленных секторах фарминдустрии,и именно в этих областях интерес к геномным и генно- инженерным исследованиям исключительно высок. Очевидно поэтому любой прогресс биотехнологий растений будет зависеть от разработки генетических систем и инструментов, которые позволят более эффективно управлять трансгенами. Ситуация аналогична той, которая наблюдается в компьютерной индустрии, где помимо увеличения объёмов обрабатываемой информации и улучшения самих компьютеров, нужны ещё и операционные системы управления информацией, типа микрософтовских “окон”. Для чистого вырезания трансгенного ДНК в растительный геном, всё больше применяют заимствованные из микробной генетики системы гомологичной рекомбинации, такие как системы Cre-lox и Flp-frt. Будущее, очевидно, будет за управляемым переносом генов от сорта к сорту, основанного на применении предварительно подготовленного растительного материала, который уже содержит в нужных хромосомах участки гомологии, необходимого для гомологичного встраивания трангена. Помимо интегративных систем экспрессии, будут опробованы автономно реплицирующиеся векторы.осбый интерес представляют искуственные хромосомы растений, которые теоретически не накладывают никаких ограничений на объём вносимой теоретической информации. Кроме этого учёные занимаются поиском генов, кодирующих новые полезные признаки. Ситуация в этой области меняется радикальным образом, прежде всего, существованию публичных баз данных, которые содержат информацию о большинстве генов, бактерий, дрожжей, человека и растений, а также в следствии разработки методов, позволяющих одновременно анализировать экспрессию большого количества генов с очень высокой пропускной способностью. Применяемые на практике методы можно разделить на две категории: 1. Методы, позволяющие вести экспрессионное профилирование: субстракционная гибридизация, электронное сравнение EST-библиотек, «генные чипы» и так далее. Они позволяют устанавливать корреляцию между тем или иным фенотипическим признаком и активностью конкретных генов. 2. Позиционное клонирование, заключается в создании за счет инсерционного мутагенеза мутантов с нарушениями в интересующем нас признаке или свойстве, с последующим клонированием соответствующего гена как такового, который заведомо содержит известную последовательность (инсерция). Вышеназванные методы не предполагают ни каких изначальных сведений о генах, контролирующих тот или иной признак. Отсутствие рационального компонента в данном случае является положительным обстоятельством, поскольку неограничен нашими сегодняшними представлениями о природе и генном контроле конкретного интересующего нас признака. Кроме всего этого группа ученых, таких как Марк Адам (ведущий сотрудник института геномных исследований в штате Мэриленд – США, частной исследовательской компании, занимающейся исключительной работой в области картирования генов), Крэйк Вентер (директор этого института) и соавторами, разрабатывается проект «Геном человека». Цель этого проекта заключается в выяснении последовательности оснований во всех молекулах ДНК в клетках человека. Одновременно должна быть установлена локализация всех генов, что помогло бы выяснить причину многих наследственных заболеваний и этим открыть пути к их лечению. Что бы последовательно приближаться к решению проблемы картирование генов человека, было сформулировано пять основных целей: 1) Завершить составление детальной генетической карты, на которой были бы помечены гены, отстоящие друг от друга на расстоянии не превышающем в среднем 2 млн. оснований (1 млн. оснований принято называть мегобазой); 2) составить физические карты каждой хромосомы (разрешение 0.1 Мб); 3) получить карту всего генома в виде охарактеризованных клонов (5 тыс. оснований в клоне или 5 Кб); 4) завершить к 2004 году полное секвенирование ДНК (разрешение одного основание); 5) нанести на полностью завершенную секвенсовую карту все гены человека (к 2005 году). Ожидалось, что, когда все указанные цели будут постигнуты, исследователи определят все функции генов и разработают методы биологического и медицинского применения полученных данных. Рассмотрев темпы ускорения работы в рамках проекта «Геном человека», руководители этого проекта объявили 23 октября 1998г., что программа будет полностью завершена гораздо раньше, чем планировалось, и сформулировали 1) полностью завершить в декабре 1998 года работу по секвенирование генома «Круглого червя» c. elegans (это было сделано в срок); 2) закончить предварительный анализ последовательности ДНК человека к 2001 году, а полную последовательность к 2003 году; 3) картировать к 2002 году геном плодовой мухи; 4) начать секвенирование генома мыши с использованием методов ДНК искусственных хромосом дрожжей (завершить этот проект к 2005 году). Помимо этих целей, официально включен в поддерживаемый правительством Международное общество секвенирование в феврале 1996 года приняло решение о том, что любая последовательность нуклиотидов размером 1-2 Кб должна быть обнародована (через Интернет) в течение 24 часов после ее установления. 2.1. ЧТО БУДЕТ СДЕЛАННО ПОСЛЕ ЗАВЕРШЕНИЯ АНАЛИЗА ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА. Главная стратегическая задача будущего сформулирована следующим образом: изучить однонуклеотидные вариации ДНК в разных органах и клетках отдельных индивидуумов и выявить различия между индивидуумами. Анализ таких вариаций даст возможность не только подойти к созданию индивидуальных генных портретов людей, что в частности даст возможность лечить болезни, но и определить различия между популяциями. А также выявлять географические районы повышенного риска, что поможет давать чёткие рекомендации о необходимости очистке территории от загрязнения и выявить производства, на которых есть большая опасность поражение геномов персонала. Эта грандиозная задача рождает не одни радужные ожидания всеобщего блага, но и вполне осознанную тревогу юристов и борцов за индивидуальные права человека. Так, в частности, высказываются возражения против распространения персональной информации без решения тех, кого она касается. Глава 3. Области практического применения генной инженерии. 3.1. Создание трансгенных растений. Еще 10 лет тому назад биотехнология растений заметно отставала в своем развитии, но за последние 3 года наблюдается быстрый выброс на рынок трансгенных растений с новыми полезными признаками. Трансгенные растения в В апреле 1998 года доля в процентах трансгенных форм растений в сельском хозяйстве составило: - кукуруза – 6 - соя – 12 - хлопчатник – 15 - томаты – |
|
Смотреть видео онлайн
Онлайн видео бесплатно